Μοριακή Διαγνωστική: real-time PCR

Επί του παρόντος, ο μηχανισμός μοριακή διάγνωση σχεδιαστεί αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), η οποία ήταν η αφορμή για την ανάπτυξη ενός μεγάλου αριθμού μεθόδων διάγνωσης ασθενειών, βασίζεται στον προσδιορισμό του γενετικού υλικού. Για την εκτέλεση πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας γονιδιακό θραύσμα (ιδίως το νουκλεϊκό οξύ) του αιτιώδους παράγοντα, η οποία δεν βρίσκεται σε άλλα άτομα.

Η αρχή της PCR είναι ο πολλαπλασιασμός ενός συγκεκριμένου εκατομμύρια θραύσμα DNA του παθογόνου φορές από DNA πολυμεράση σε μια ειδική μονάδα, που αναφέρεται ως θερμικό ανακυκλωτή, η οποία παρέχει μια κυκλική επανάληψη του καθεστώτος θερμοκρασίας για ένα δεδομένο πρόγραμμα.

Διαγνωστικά PCR επιτρέπει να επαναλάβει μια σειρά από ενισχύσεις, τη διατήρηση της δραστικότητας του ενζύμου. Όταν η ενίσχυση λαμβάνει χώρα ομαλά, σε ένα κύκλο τον αριθμό των αντιγράφων ενός συγκεκριμένου τεμαχίου DNA των διπλασιάζεται παθογόνου, μετά από τριάντα κύκλους - ένα εκατόν δέκα. Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο PCR χρησιμοποιείται στη διάγνωση για να καθοριστεί αρκετά μικρή παθογόνα, η αναγνώριση των οποίων είναι αδύνατη χωρίς αυτήν.

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι το RNA δεν μπορεί να είναι ένα πρότυπο για PCR σε πραγματικό χρόνο. Ως εκ τούτου, προκειμένου να ανιχνευθούν ιικό RNA πριν από την ενίσχυση για να πάρει το DNA συσχετίζεται με το αντίστοιχο θραύσμα από αυτό. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης επιτρέπει την παραγωγή DNA και RNA παθογόνου μέτρησης. Η πληροφορία που λαμβάνεται έτσι χρησιμοποιείται για την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας που χρησιμοποιείται, και την αξιολόγηση της κλινική πρόγνωση.

Επιπλέον, PCR πραγματικού χρόνου δεν απαιτεί πρόσθετες ενέργειες σε σχέση με την αποκρυπτογράφηση του DNA στόχου ή αμπλικόνια, οι οποίες χρησιμεύουν ως εμπόδιο για την σωστή διάγνωση και να οδηγήσει σε λανθασμένα αποτελέσματα. Η προσέγγιση αυτή καθιστά δυνατή τη μη χρησιμοποιήσει το βήμα ηλεκτροφόρησης, η οποία οδηγεί σε μια προϊόντα μείωσης των κινδύνων της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Επίσης, λόγω της μείωσης του αριθμού των χειρισμών με τον παράγοντα, μειώνει το χρόνο της έρευνας, αυτό απλοποιεί τη διαδικασία, μειώνει την πιθανότητα λαθών. PCR επιτρέπει επίσης να καθορίσετε τον αρχικό αριθμό των αντιγράφων του DNA του παθογόνου σε μια κλινική δοκιμή για να βοηθήσει στον εντοπισμό περιόδους εξάρσεων και να λάβουν έγκαιρα μέτρα για να θεραπεύσει τον ασθενή.

Σήμερα, υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός μεθόδων ενίσχυσης της καθήλωσης σε πραγματικό χρόνο. Τα συνηθέστερα χρησιμοποιούμενα διάφορες τεχνικές εφαρμογής αμπλικονίου συσχετίζεται με φθορογόνο ανιχνευτές, η ένταση της ακτινοβολίας της οποίας ποικίλει ανάλογα με τη συσσώρευση των amplicon και καταγράφονται σε πραγματικό χρόνο με τη βοήθεια μιας ειδικής συσκευής που ονομάζεται θερμικό κυκλοποιητή με μια οπτική μονάδα. Παρέχει ένα υψηλό επίπεδο ευαισθησίας της ανάλυσης. Κατά το ίδιο προϊόν PCR μπορεί να ανιχνευθεί, μαζί με μια μεγάλη ποσότητα παραπροϊόντων, σε μια χρονική στιγμή χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση αυτό σε ορισμένες περιπτώσεις δεν είναι παρατηρήσει.

Με PCR με τη χρήση θετικών και αρνητικών δειγμάτων ελέγχου σε πραγματικό χρόνο. Έτσι, δείγματα θετικού και αρνητικού σε μια μελέτη αναλύθηκαν ως ξεχωριστά δείγματα, ένα δείγμα ελέγχου, όπου εισάγεται σε κάθε τέτοιο δείγμα και περνά όλα τα βήματα ανάλυσης.

Σήμερα, υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός συσκευών για τη διεξαγωγή της αλυσωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Αυτές περιλαμβάνουν Bio-Rad, Applied Biosystems, Cepheid και η Roche. Κάθε ένα από αυτά έχει τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματα

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η PCR - μέθοδος διάγνωσης χρησιμοποιείται σε μεγάλης κλίμακας επιστημονική, ερευνητική και διαγνωστικά κέντρα σε όλο τον κόσμο, γιατί δίνει την ευκαιρία να πραγματοποιήσει άμεση ερμηνεία των αποτελεσμάτων.